PRELIFETM-EVA TESZT

INFORMÁCIÓ SZAKEMBEREKNEK
HÁTTÉRINFORMÁCIÓK

Becslések szerint hazánkban 150 ezer párt érint a meddőség problémája. A 30‐as éveik vége fele járó párok 33%-a meddőnek tekinthető. A magyarországi Központi Statisztikai Hivatal (KSH) adatai szerint az élveszületési arány 12-ről 8 és fél ezrelékre csökkent. az in vitro fertilizációs kezelések hatékonyságának javítása növelheti a megszületett gyermekek számát.
Nemzetközi és hazai trend, hogy a gyermekvállalás időpontja egyre későbbi életkorba tolódik. Az életkor előrehaladtával azonban a teherbeesés esélye csökken. Gyakori probléma, hogy a lombikprogramba a párok viszonylag későn kapcsolódnak be. Sajnálatosan a beavatkozás sokszor a legjobb szakmai háttér mellett sem hozza meg a kívánt eredményt.
Az embrió beágyazódása függ az embrió minőségétől és endometrium állapotától, illetve a női immunrendszertől. Amennyiben az embrió minősége megfelelő, az endometriumba való beágyazódásra egy viszonylag szűk, maximum néhány napos periódusban az implantációs ablakban van lehetőség. Ez szabályos 28 napos ciklus esetén a ciklus általában a 19-21. napon következik be, az ovuláció után 5-7 nappal.

Az endometrium receptivitásának jelentősége IVF során

Az endometrium állapota szövettani és képalkotó módszerekkel vizsgálható. Az endometrium állapotának monitorozása rutinszerűen ultrahanggal történik, mivel ez könnyen elérhető, gyors és non-invazív vizsgálat. Számos esetben bebizonyosodott azonban, hogy az endometrium receptív és nem receptív állapota nem különíthető el egyértelműen ezzel a módszerrel.
Megfigyelték, hogy az endometrium génexpressziós mintázata párhuzamba állítható az endometrium állapotával a ciklus különböző fázisaiban. A teljes genomi vizsgálatot normális ovulációjú nőkben végezték. Génklaszter analízissel megállapították, hogy a gének expressziós mintázatuk alapján jellemezni képesek a proliferatív endometriumot (PE), a korai szekréciós endometriumot (ESE), középső szekréciós endometriumot (MSE) és a késői szekréciós endometriumot (LSE), amelyek egyben a menstruációs ciklus fázisait jelzik. A ciklus bármely idejében nyert méhnyálkahártya mintáknak egyedi molekuláris szignatúrájuk van. Ugyanakkor, ezek a molekuláris szignatúrák nem azonosak, egyénenként jelentős variabilitást mutatnak.

ENDOMETRIÁLIS RECEPTIVITÁS MOLEKULÁRIS VIZSGÁLATA - PRELIFETM-EVA TESZT

MI A PRELIFETM-EVA MÓDSZER?

Az, hogy az implantációs ablak melyik ciklusnapra esik, személyenként eltérő lehet. Jelenleg döntően ultrahangos vizsgálatok indirekt eredményeiből lehet következtetni ennek idejére. Emellett biokémiai markerek segítségével - mint, a vizeletből vagy vérből történő luteinizáló hormon csúcskoncentráció (LH-csúcs) méréséből - is kísérletet lehet tenni az implantációs ablak meghatározására. Azonban a viszonylag nagy egyéni különbségek miatt ez nem biztos módszer. Az LH-csúcs valójában a tüszőrepedést, azaz az ovulációt jelzi, de nem ad egyértelmű felvilágosítást a méhnyálkahártya állapotáról.
A PRELIFETM-EVA (PRELIFETM - Endometrium Validation Assay) módszer közvetlenül alkalmas a méhnyálkahártya állapotának ellenőrzésére és az implantációs ablak időszakának meghatározására. A vizsgálat során endometrium biopsziát végeznek a tervezett embrióbeültetést megelőző ciklusban. A mintavétel a ciklus azon pontján történik, amikorra az embrió beültetést tervezik, a korábbi ultrahang és biokémiai paraméterek segítségével meghatározott implantációs ablak alapján. A biopszia során nyert szövetdarabból a laboratóriumban ún. kvantitatív PCR (qPCR) mérés segítségével feltérképezik a méhnyálkahártya génkifejeződési mintázatát. A mérési eredmények analízise során referencia értékekhez hasonlítva megállapítják, hogy az előzetesen kalkulált implantációs ablak periódusban levett méhnyálkahártya minta alkalmas lenne-e az embrió befogadására. Vagy az endometrium a valódi implantációs ablakot ezen periódust megelőzően vagy ezt követően éri el.

LÉTEZIK-E SZAKMAI IRÁNYELV A MÉHNYÁLKAHÁRTYA BIOPSZIA VIZSGÁLAT INDIKÁCIÓJÁRÓL?

A meddőségi kivizsgálás jelenleg érvényes szakmai protokollja (Egészségügyi Minisztérium szakmai protokollja, a 2019. EüK. 14. szám EMMI szakmai irányelv) az endometrium biopsziát ajánlja a meddőség kivizsgálásához szükséges ovuláció igazolására.
„Ovuláció igazolása (Level II-2): endometrium biopszia, mely az ovulációt követő jellegzetes szekréciós változásokat mutatja.”

A szakmai irányelv bevezetőjében található iránymutatás szerint „egy-egy célra többféle vizsgálat is alkalmas lehet”, mely kitétel lehetőséget ad a legcélravezetőbb vizsgálat igénybevételére.
Nemzetközi gyakorlatban elérhető, hasonló célra használt génexpresszió alapú endometrium implantációs ablak vizsgálat indikációja az embrióbeágyazódási sikertelenség (Implantation Failure), mely alatt két ismeretlen okból sikertelen IVF-ciklust értünk.

AZ IMPLANTÁCIÓS ABLAK VIZSGÁLATÁNAK RELEVANCIÁJÁRA VONATKOZÓ KLINIKAI MEGFIGYELÉSEK

Egy, 186 beteg bevonásával végzett vizsgálat, mely az endometrium receptivitást vizsgálta, megállapította, hogy az ismétlődő sikertelen embrió beágyazódások (RIF) hátterében az esetek 27,5%-ában az implantációs ablak eltolódása állt. Szemben azon fertilitási problémával küzdő nőkkel, akiknél beágyazódási zavar nem volt azonosítható, az implantációs ablak eltolódását csak 15%-ban detektálták.

Endometrial receptivity array: Clinical application. J Hum Reprod Sci. 2015 Jul-Sep;8(3):121-9. doi: 10.4103/0974-1208.165153.
Egy másik vizsgálatban az ismétlődő implantációs zavarban szenvedő (RIF) összesen 248 nőnek a 17,7%-a mutatott implantációs ablak eltolódást, mely az esetek közel két harmadában korai szekretoros (pre-receptív) fázis képét mutatta.

Personalized Embryo Transfer Helps in Improving In vitro Fertilization/ICSI Outcomes in Patients with Recurrent Implantation Failure. Patel et al, J Hum Reprod Sci. 2019 Jan-Mar; 12(1): 59–66. doi: 10.4103/jhrs.JHRS_74_18

Az ismétlődő implantációs zavarban (RIF) szenvedő betegek mintáin végzett molekuláris endometrium vizsgálat kimutatta, hogy a klasszikus időzítéssel végzett embriótranszfer időpontjában az endometrium csak az esetek 20%-ában volt receptív, 80%-ban az implantációs ablak 1-3 nappal késett.
Customized Frozen Embryo Transfer after Identification of the Receptivity Window with a Transcriptomic Approach Improves the Implantation and Live Birth Rates in Patients with Repeated Implantation Failure. Delphine Haouzi et al. Reprod Sci. 2020 Jul 28. doi: 10.1007/s43032-020-00252-0

Az ERA-RCT Study 4585 beteget vizsgált egy multicentrikus, randomizált, nemzetközi vizsgálatban, hogy felmérje a személyre szabott embriótranszfer indokoltságát. Az implantációs ablak meghatározásával végzett első, személyre szabott embriótranszfer teljes élveszületés rátája (Live Birth Rate, LBR) 56,2% volt, szemben a standard eljáráson alapuló? – itt nem volt WOI vizsgálat, ugye? 42,2%-os fagyasztott embriótranszfer (Frozen Embryo Transfer, FET) és a 45,7%-os friss embriótranszfer hatékonyságához képest. Ennél szembetűnőbb, hogy az implantációs ablakot figyelembe vevő személyre szabott embriótranszfer 71,2%-ban vezetett születési sikerhez (Cumulative Live Birth Rate, CLBR), míg a FET megközelítés csak 55,4%-ban és a friss embriótranszfer 48,9%-ban bizonyult hatékonynak. A vizsgálat bizonyította, hogy a személyre szabott embriótranszfer-protokoll tartós használata szignifikánsan jobb eredményekhez vezet.
A 5-year multicentre randomized controlled trial comparing personalized, frozen and fresh blastocyst transfer in IVF, RBMO, 2020 Sept, 01, Simon et al, doi.org/10.1016/j.rbmo.2020.06.002

MINTAVÉTELI INFORMÁCIÓK

Az endometrium biopszia mintavétel az ovuláció (tüszőrepedés), illetve az analitikai módszerekkel meghatározott luteinizáló hormon (LH)-csúcs utáni hetedik napon (LH+7) javasolt vagy progeszteron pótlás esetén a gyógyszeres kezelés megkezdését követő ötödik (P+5) napon.
Amennyiben a páciens hCG hormont kap, a mintavétel a hCG injekció beadása utáni 7. napon történik.

Az endometrium biopszia bevett orvosi beavatkozásnak számít melyre szakmai leírások léteznek. Jelen tájékoztató nem módszertani leírás. A mintavétel menetéről részletes leírás található a szakirodalomban. (Ingyenesen hozzáférhető ajánlott irodalom: Endometrial Biopsy, THOMAS J. ZUBER, Am Fam Physician. 2001 Mar 15;63(6):1131-1135. https://www.aafp.org/afp/2001/0315/p1131.html)

A PRELIFETM-EVA teszt elvégzéséhez a hivatkozott cikkben szereplő leíráshoz képest alapvető eltérés, hogy a minta nem formaldehides oldatban kerül fixálásra, hanem a mintaszállító KIT-hez tartozó, RNS stabilizáló oldatot tartalmazó (PAX) csőbe kell helyezni az alábbiak szerint:

Nyissa ki a stabilizáló folyadékot tartalmazó mintagyűjtő (PAX) csövet.
Helyezzen a mintából maximum két zöldborsónyi méretű darabot, vagy ennek megfelelő mennyiségű kisebb bioptátum darabokat a stabilizáló oldatba. Zárja le a csövet a dugójával.

Forgassa fel-le néhányszor a csövet, hogy a mintadarabok mindenképp a stabilizáló oldatba kerüljenek.
Helyezze a mintát tartalmazó csövet a szállítótartályba a szállítási egységcsomagban leírt módon.
A mintavételhez szükséges orvosi eszközök, úgymint egyszerhasználatos Pipelle vagy Endobiops katéter, steril és egyéb eszközök, egységesen "Kiegészítő elemek" beszerzése, tárolása és a szakma szabályai szerinti használata a mintavételt végző szakember és centrum felelőssége.

A PRELIFETM-EVA VIZSGÁLAT LABORATÓRIUMI HÁTTERE

A stabilizált endometrium biopszia mintából első lépésben totál RNS izolálás történik, melyből reverz transzkripció során komplementer DNS (cDNS) képződik.

A szintetizált cDNS mix előre legyártott mikroplate lemezeken kvantitatív PCR (qPCR) technikával felsokszorosításra kerül, majd fluoreszcens hidrolízis próbákat használva mennyiségi meghatározás történik. Az alkalmazott molekuláris vizsgálat egyidőben 94 párhuzamos génexpressziós mérést végez el. A qPCR kvantifikálásra alkalmas molekuláris módszer, mely gének kifejeződését képes számszerű eredmények formájában meghatározni. Az adott mintából kapott eredményeket publikált és két független patológus által kétnapos fázis szakaszokba sorolt referencia endometrium minták expressziós értékeihez viszonyítva elemzik. A referenciaadatokból felállított modell szerint a vizsgált minta génexpressziós mintázata alapján klasszifikálható. Az eredmény kiegészítő információt nyújt az IVF kezelés során szükséges klinikai döntéshozatalhoz, így a megfelelő implantációs ablakban történő sikeres embrióbeültetéshez. Amennyiben a minta nem követi az LH csúcs szerinti várt besorolást, azaz fáziseltolódás mutatható ki, úgy a páciens esetében személyre szabott kivizsgálás és kezelési protokoll kidolgozása indokolt.

A mérési eredmények alapján a laboratórium szakvéleményt állít ki. A megfelelő kivizsgálás és kezelés megválasztása minden esetben a kezelőorvos kompetenciája, aki döntését valamennyi rendelkezésére álló klinikai és diagnosztikai adat birtokában hozza meg. A PRLIFETM-EVA módszer mérési eredménye döntéstámogató, kiegészítő adatnak tekintendő.

A PRELIFETM-EVA MÓDSZER KIDOLGOZÁSÁNAK ÉS VALIDÁLÁSÁNAK SZAKMAI ÖSSZEFOGLALÁSA

Hogyan történt az expressziós vizsgálatban használt reprezentatív gének kiválasztása?
A Debreceni Egyetem Általános Orvostudományi Karának Genomi Medicina és Bioinformatikai Szolgáltató Laboratóriumának munkatársai szolgáltatási szerződés keretében a Prelife Kft. megbízásából elvégezték a Talbi és munkatársai 2006-ban az Endocrinology c. szakfolyóiratban publikált adatainak újraelemzését. Az elemzés alapján sikerült egy kisebb releváns géncsoportot kiválasztani, mely alkalmas az endometrium fázisbesorolására. A Prelife Kft. hazai klinikai vizsgálat keretében mintagyűjtést végzett, melyben vizsgálta a teljes munkafolyamat megvalósíthatóságát és a mérési rendszer analitikai teljesítőképességét, stabilitását, reprodukálhatóságát.

Hogyan történt a referenciaminták kiválasztása?
Talbi és munkatársai 2006-ban az Endocrinology c. szakfolyóiratban ismertették eredményeiket: Molecular Phenotyping of Human Endometrium Distinguishes Menstrual Cycle Phases and Underlying Biological Processes in Normo-Ovulatory Women”, doi: 10.1210/en.2005-1076. A vizsgálatban endometrium biopszia mintákat soroltak kétnapos fázis szakaszokba. A besorolást akkor fogadták el, ha két független patológus fázisbesorolása azonos volt. A minták korai, közép és kései szekretoros fázisok szerint kerültek klasszifikálásra. Két fázis közötti elfogadott távolság két nap volt.

Hogyan értékelhetőek a mérés eredményei?
A mérési eredmények matematikai algoritmus alkalmazásával (nearest neighbour - módszer) összehasonlíthatók a referenciaminták értékeivel. Valamennyi egyedi génre elvégezve az összehasonlítást megállapítható, hogy egy adott minta melyik referenciacsoporthoz (receptivitási fázishoz) áll a legközelebb a vizsgált expressziós markerek szempontjából. Valamint, hogy a másik két referenciacsoporttól számított távolsághoz képest ez a távolság statisztikailag szignifikánsnak tekinthető-e.

Vannak-e klinikai adatok arra vonatkozóan, hogy a módszer valós betegmintákon használható?
A Prelife Kft. által végzett klinikai vizsgálat adatai alapján a módszer endometrium biopszián használható. A klinikai vizsgálat kimutatta, hogy valós klinikai mintákon a referenciamintákhoz képest a fázisbesorolás nem minden esetben egyértelmű, a minták egy része a kétnapos ablakokra bontott referenciacsoportok között foglalt helyet. Azonban ez az adat klinikailag használható, mivel az IVF szakember számára jelzi, hogy a vizsgált időpontban a beteg két referencia fázis közötti állapotban található.

A PRELIFETM-EVA génexpressziós alapú molekuláris teszt analitikai jellemzői

1. A módszer analitikai variabilitása, vagyis az analitikai tesztelés során megállapított inter-operátor variabilitás relatív szórása (coefficient of variation, CV) kisebb, mint 5,3%.

2. A matematikai modell teljesítőképessége: a modellfelállításhoz 16 db referenciaminta került bevonásra. A használt matematikai modell autovalidálása során annak közép-szekretoros fázis (MSE) meghatározásra számított pontossága 94%, szenzitivitása 100%, specificitása 88%, pozitív prediktív értéke 89%, negatív prediktív értéke 100%. A számokat értelmezve elmondhatjuk, hogy az keresztvalidálás során valamennyi MSE mintát sikerült azonosítani, de tévesen előfordult nem MSE státuszú minta MSE besorolása is.

3. A klinikai vizsgálatban tapasztalt minta előfordulási arányok. A klinikai vizsgálat során 56 db endometrium biopszia volt értékelhető, melyek eloszlása a következők szerint alakult:

korai szekretoros fázis (ESE) 6/56 = 10,7%
korai és közép szekretoros fázis átmenete (ESE-MSE) 17/56 = 30,4%
közép szekretoros fázis (MSE) 31/56 = 55,4%
közép és kései szekretoros fázis átmenete (MSE-LSE) 1/56= 1,8%
kései szekretoros fázis (LSE) 0/56 = 0%
nem besorolható 1/56 = 1,8%

Kérjük, olvassa el a szakemberek részére összeállított részletes módszertani tájékoztatót és mintavételi információkat illetve látogasson el a prelife.hu oldalra! (Itt a prelife.hu-ra kellene átirányítani a pácienst)

A vizsgálattal kapcsolatos letölhető dokumentumok:

Amennyiben Önt érdekli ez a vizsgálat, kérjük, hívja bizalommal a 06-80-69-69-69-es ingyenes számot, vagy érdeklődjön online !

 
Vissza a vizsgálatokhoz